转染试剂的操作小步骤

  我们经常会用到转染试剂来转染一些细胞，那您知道一些具体的操作步骤吗？下面将详细为您讲解具体的实验步骤。

  转染前 ：

   首先，准备细胞、质粒和实验所需试剂。细胞可以取实验室里已经验证的易转染细胞株，如COS-1/Hela/CHO-K1细胞，同时实验前要重新复苏一株低传代细胞来确保该细胞株未被其他细胞和微**污染。选择表达质粒载体如β-gal载体，GFP载体等时，要先确保该质粒能在所选的细胞系中表达良好。同时质粒纯化时要注意纯化过程中勿使双链断裂以及无核酸酶和内**污染。同时准备新鲜的培养基，使用前用0.22um滤膜过滤培养基来确保培养基无污染。细胞培养过程中勿加***，且需要不断监测细胞的生长情况。当细胞密度达到50-80%时，可用于细胞转染。

2.转染中：

  首先，由于不同质粒和脂质体的较适合的搭配比例不同，转染前应该做预实验来摸索一个较合适的配比。作预实验时，按照质粒：脂质体=1:1、1:2、1:3、1:4的梯度来检测比较合适的转染比例，同时也需要设立对照实验，如试剂对照：仅加入转染试剂，可确定转染试剂对细胞**。DNA对照：仅加入DNA，确定制备DNA的质量是否对细胞存在影响。空白对照：用空载体制备转染试剂复合物（建议3：1的比例），确定转染后细胞生理或功能的变化是源于目标基因，还是源于转染过程本身。 其次，在正式实验中，需要小心轻柔将lipo2000加到培养基中并轻轻混匀，避免大力吹打，使得脂质体失效。

3.转染后：

   首先，转染24h后需要观察转染过程对细胞**情况，如果**比较高，可能是由以下原因造成的： *初期细胞接种浓度太低*转染复合物加入量过高，因为不同细胞对转染的敏感度不同*转染后6小时需更换培养基，一是lipo2000具有一定**，二是培养基需要更换成有血清培养基。 其次，转染后需要对转染效率进行检测，比如观察转染后细胞荧光情况、qPCR验证或WB检测敲减或者过表达蛋白。 *对于β-gal表达载体：可用β-gal染色***进行细胞染色并观察细胞。转染效率高的细胞在染色孵育后3-4h即可观察到，转染效率低的细胞则需要更长的孵育时间。 *对于GFP表达载体：荧光显微镜下观察细胞。如果细胞能在显微镜下被观察到，至少需要有104-105拷贝的GFP蛋白表达，表达太弱的细胞无法镜检。GFP表达情况也能使用流式细胞仪进行检测，同时可加入PI进行染色以监测死细胞情况。 **，若是转染后发现转染效率不高，可以通过两种方法增强转染效率。 （1）复转染，即转染后12-24小时再次进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。 （2）通过*筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有***抗性的基因。

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  看完这些，您是不是更加了解该如何进行转染实验了呢？